RNA的提取方法總匯
點擊次數(shù)：358 更新時間：2024-05-13
獲得高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行很多分子實驗（RT-qPCR，二代測序轉(zhuǎn)錄組分析，芯片分析，數(shù)字PCR，northem分析及cDNA文庫構(gòu)建等）的第一步，往往也是最關(guān)鍵的一步，下面主要講解的是RNA的八種提取方法。
1、熱酚法
本法主要用于少量細(xì)胞樣品RNA提取，其產(chǎn)量不高，但簡單易行。
2、快速提取法
本法主要用于培養(yǎng)細(xì)胞，通過0.5%SDS裂解細(xì)胞，酚抽提去除蛋白質(zhì)和DNA沉淀，快速純化RNA。
3、鹽酸胍-有機(jī)溶劑法
本法由MacDonald 1987年在Strohman報道的方法基礎(chǔ)上改進(jìn)而成的，適用于沒有超速離心及設(shè)備的情況下提取細(xì)胞總RNA。它利用鹽酸胍抑制RNA酶，勻漿裂解細(xì)胞，有機(jī)溶劑抽提去除蛋白質(zhì)，通過選擇性沉淀RNA分子而去除DNA，提取的RNA質(zhì)量較好，但整個操作過程繁雜費時。
4、氯化鋰-尿素法
本法首先由Auffray報道，利用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時抑制RNA酶，3mol/L LiCl選擇性沉淀RNA。其缺點是有時會存在DNA污染，LiCl沉淀RNA會丟失一些小分子量的RNA，如5S RNA等。優(yōu)點是快速簡捷，尤其適用于大量樣品少量組織細(xì)胞的RNA提取，其質(zhì)量可以滿足Northern分析，Oligo(dT)提取mRNA，SI核酸酶或RNase保護(hù)實驗等。本法每提取107個細(xì)胞能提取總RNA約10?g。
5、異硫氰酸胍氯化銫超速離心法
原理：使用蛋白質(zhì)變性劑異硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，經(jīng)過起始密度為1.78g/ml的氯化銫介質(zhì)，進(jìn)行密度梯度超速離心，RNA沉淀于管底，而DNA與蛋白質(zhì)在上清中。使用這種方法，不但能得到高質(zhì)量的RNA，而且能同時分離出細(xì)胞染色體DNA. 本法對于冷凍時間長、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不易分離的組織標(biāo)本以及富含RNA酶的組織細(xì)胞(如胰腺)的RNA提取尤其適合。此法提取的RNA的質(zhì)量好和成功率高，已成為提取哺乳動物細(xì)胞RNA的常規(guī)方法。其缺點是操作復(fù)雜、流程長，一次提取的樣品數(shù)量有限。
6、細(xì)胞質(zhì)RNA提取法 本法主要適用于培養(yǎng)細(xì)胞，首先去除細(xì)胞核，然后用蛋白酶K消化蛋白質(zhì)，酚/抽提去除蛋白質(zhì)。操作簡單，同時能進(jìn)行多個樣品操作，多數(shù)步驟在室溫下進(jìn)行，提取的RNA質(zhì)量較高，可滿足體外無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)、cDNA合成、引物延伸以及核酸酶SI保護(hù)實驗。本法提取的RNA產(chǎn)量一般為30～500?g/107個細(xì)胞。
7、酚-氯化鋰法同時提取細(xì)胞RNA和DNA
本法是在Elion和Warner報道的方法基礎(chǔ)上，有Sandeep等人于1990年改進(jìn)而成。它通過酚和SDS裂解細(xì)胞，變性，解聚蛋白，抑制RNase，并用EDTA保護(hù)DNA，最后根據(jù)RNA和DNA在Li+中的不同沉淀速度，而分離DNA和RNA。整個過程在2小時內(nèi)完成。RNA可用于Northern分析，DNA可用于內(nèi)切酶消化以及Southern雜交實驗。
8、一步快速熱酚抽提法
基于Shomczynki和Sacchi兩人于1987年報道的RNA快速提取法，美國Promega公司有機(jī)地將這些試劑組合成總RNA試劑盒，使操作更為簡單方便，并突出體現(xiàn)以下幾個優(yōu)點：1)將已異硫氰酸胍、b-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉聯(lián)合使用，抑制了RNA的降解，增強(qiáng)了對核蛋白復(fù)合物的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離進(jìn)入溶液，提高了RNA的提取產(chǎn)量；2)RNA選擇性地進(jìn)入無DNA和蛋白質(zhì)的水相，容易被異丙醇沉淀濃縮，對大量或少量組織的細(xì)胞RNA提取，均甚合適；3)可在3小時以內(nèi)處理大量樣品，省略了氯化銫密度梯度超速離心步驟及其它方法使用的長時間選擇性乙醇沉淀或LiCl沉淀。LiCl沉淀不但會導(dǎo)致小RNA(<5.8S)的丟失，而且Li+鹽的殘留還會抑制DNA的合成反應(yīng)。
